一、前言

氨基酸（AminoAcids），作為蛋白質(zhì)的基本組成單位，是生命活動不可或缺的重要分子。它們不僅參與構(gòu)建生物體的組織結(jié)構(gòu)，還在代謝調(diào)節(jié)、信號傳遞等生命過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。近年來，隨著生物技術(shù)和分析方法的飛速發(fā)展，對氨基酸的研究不斷深入，其應(yīng)用領(lǐng)域也日益廣泛，涵蓋了食品科學(xué)、醫(yī)藥研發(fā)、營養(yǎng)健康等多個方面。氨基酸由氨基、羧基、側(cè)鏈基團(tuán)和中心碳原子組成，其側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的差異決定了20種常見氨基酸的獨(dú)特性質(zhì)。氨基酸的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)決定了其極性、電荷、親水性/疏水性等性質(zhì)，這些性質(zhì)進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。

為了準(zhǔn)確測定氨基酸的種類和含量，科學(xué)家們開發(fā)了多種檢測方法，包括色譜法、電泳法、質(zhì)譜法等。這些方法各有千秋，比如高效液相色譜法（HPLC）憑借其高分離度和高靈敏度脫穎而出，而質(zhì)譜法（MS）則因能提供精確的分子量信息而備受青睞。然而，現(xiàn)有的氨基酸檢測方法仍存在一些局限性，其分析技術(shù)仍面臨顯著瓶頸：（1）直接檢測局限：僅色氨酸、酪氨酸等少數(shù)含芳香環(huán)氨基酸可通過紫外吸收（280 nm）直接檢測，其余需依賴衍生化（如OPA、丹磺酰氯）增強(qiáng)信號；（2）衍生化弊端：步驟煩瑣、衍生物穩(wěn)定性差（如OPA衍生物半衰期<5 min）及產(chǎn)生嚴(yán)重基質(zhì)干擾。

因此，開發(fā)新型氨基酸檢測方法，提高檢測效率、降低成本、簡化操作流程，是當(dāng)前氨基酸研究領(lǐng)域的重要方向。

圖1：氨基酸的結(jié)構(gòu)通式圖

電霧式檢測器（CAD）是一種通用型檢測器，適用于多種化合物的分析，尤其在對缺乏紫外吸收的化合物檢測方面具有顯著優(yōu)勢。其工作原理是通過將樣品轉(zhuǎn)化為帶電的氣溶膠粒子進(jìn)行檢測，具有高靈敏度、寬線性范圍以及良好的選擇性。本研究采用配備Sparkflux-2000型電霧式檢測器（CAD）的高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)，旨在開發(fā)一種免衍生、高靈敏氨基酸檢測分析方法，為了驗(yàn)證方法，同步對比了分別采用Corona^TMVeO^TMRS-CAD和Sparkflux-2000-CAD以及CAD的檢測結(jié)果。

二、樣品配置方法

2.1 樣品

L-苯丙氨酸、L-丙氨酸、L－蛋氨酸（甲硫氨酸）、L-谷氨酸、 L-胱氨酸 、L-精氨酸、 L-賴氨酸、 L-酪氨酸、L-亮氨酸（白氨酸）、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-天冬氨、 L-纈氨酸、L-異亮氨酸、L-組氨酸、甘氨酸、 L-色氨酸，純度>98%。

2.2 配置方法

用純水將氨基酸配置成濃度為500 ppm的混合溶液。

三、分析條件

樣品濃度：500 ppm氨基酸混合樣品

色譜柱：Acclaim^TM120C18 柱（250 mm×4.6mm，5um）

流動相：乙腈/10mM七氟丁酸水溶液，流速：0.8 mL/min

CAD檢測條件：蒸發(fā)溫度（40^oC）

四、結(jié)果與討論

4.1 UV、Corona^TMVeo^TMRS-CADvs Sparkflux-2000-CAD分析氨基酸

如圖2所示，通過CAD色譜圖我們可以看出，采用10 mM七氟丁酸作為流動相添加劑，可以使得絕大部分氨基酸獲得很好的分離，這源于七氟丁酸的較強(qiáng)酸性，以及起到離子對作用。

首先對比紫外檢測和兩種CAD檢測結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在乙腈/10 mM七氟丁酸水溶液梯度洗脫條件下，CAD檢測器能夠?qū)崿F(xiàn)對十八種氨基酸的高靈敏度檢測，峰型對稱尖銳，且基線較為穩(wěn)定。相比之下，紫外檢測器在210 nm、254 nm和280 nm這三個波長下存在顯著局限，僅能對具有共軛結(jié)構(gòu)的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等少數(shù)氨基酸有響應(yīng)，而大多數(shù)缺乏發(fā)色團(tuán)的氨基酸則無法被有效檢測。這一結(jié)果有力地證明了CAD檢測器在氨基酸分析領(lǐng)域的卓越優(yōu)勢，其檢測能力不受氨基酸發(fā)色團(tuán)限制，能夠?qū)崿F(xiàn)對更多種類氨基酸的全面覆蓋。

其次對比Corona^TMVeo^TMRS-CAD和Sparkflux-2000-CAD結(jié)果，十八種氨基酸在兩種CAD上均能獲得較高響應(yīng)信號。但是從響應(yīng)強(qiáng)度上，氨基酸在Sparkflux-2000-CAD上響應(yīng)高于Corona^TMVeo^TMRS-CAD。如表1統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)表明，前者峰面積約為后者的兩倍，因?yàn)檫M(jìn)樣量相同，這表明Sparkflux-2000-CAD具有更高的靈敏度，這個也進(jìn)一步通過S/N計(jì)算可以獲得印證，各氨基酸在Sparkflux-2000-CAD上信噪比均高于Corona^TMVeo^TMRS-CAD。這與Sparkflux-2000-CAD采用免稀釋的直接電暈充電模式（DCCM）有關(guān)。

圖2：UV、Corona^TMVeo^TMRS-CAD與Sparkflux-2000-CAD分析結(jié)果對比圖

1、甘氨酸 2、絲氨酸3、天冬氨酸4、丙氨酸5、蘇氨酸 6、谷氨酸7、胱氨酸 8、賴氨酸 9、組氨酸10、精氨酸 11、脯氨酸 12、纈氨酸13、蛋氨酸14、酪氨酸 15、異亮氨酸 16、亮氨酸 17、苯丙氨酸18、色氨酸。

表1. 氨基酸在 Corona^TMVeo^TMRS-CAD與Sparkflux-2000-CAD上的峰面積與S/N統(tǒng)計(jì)

（1、甘氨酸   2、絲氨酸   3、天冬氨酸   4、丙氨酸   5、蘇氨酸    6、谷氨酸   7、胱氨酸   8、賴氨酸   

9、組氨酸   10、精氨酸   11、脯氨酸   12、纈氨酸   13、蛋氨酸   14、酪氨酸   15、異亮氨酸   

16、亮氨酸   17、苯丙氨酸   18、色氨酸）

五、總結(jié)

Sparkflux-2000-CAD方法作為分析氨基酸樣品的先進(jìn)技術(shù)手段，因其獨(dú)特的檢測原理和技術(shù)優(yōu)勢，已成為替代傳統(tǒng)紫外檢測器檢測無發(fā)色團(tuán)氨基酸樣品的最佳選擇之一。該方法避免了繁瑣的衍生化步驟，顯著簡化了樣品前處理流程，同時保證了檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，Sparkflux-2000-CAD方法不僅能有效檢測各類無發(fā)色團(tuán)氨基酸，其關(guān)鍵性能指標(biāo)均優(yōu)于傳統(tǒng)檢測方法。這種技術(shù)突破不僅解決了無發(fā)色團(tuán)樣品分析的技術(shù)難題，其高效、簡便的特性更展現(xiàn)了在臨床診斷、食品分析和生物制藥等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用潛力，為復(fù)雜基質(zhì)中氨基酸的定量分析提供了新方法。